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| 用途

 

    體內 Cdc42 激活水平的分析。

    檢測增強 Cdc42 活性的化合物和蛋白質。

    檢測抑制 Cdc42 活性的化合物和蛋白質。

    對細胞（組織）中的 Cdc42 活性進行定位、定性、定量研究。

 

 

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| 產品說明

 

    小G蛋白是從屬于細胞調節因子中的一個超家族。Rho家族是小G蛋白中的一個亞家族，它在細胞運動、細胞分裂以及基因轉錄中發揮主要作用。而本試劑盒中的Cdc42就屬于Rho亞家族中的一種，Cdc42參與生理活動過程中其分子結構會呈現出2種相互轉換的形式：與GTP結合的激活狀態和與GDP結合的非活性狀態。

 

   目前Cdc42蛋白活性的檢測主要是依據小GTP酶Cdc42可以與p21活化激酶（PAK）的p21結合區域（PBD）結合，使PAK活化從而發揮生物學功能，進而間接的進行Cdc42活性功能的監測。然而此方法在檢測過程中存在著一定的局限性比如GTP水解成GDP的速度過快以及Cdc42-GTP結合蛋白與p21結合區域之間較低的親和力，導致這種檢測方法的重復性較差。

   

   武漢紐萊生物科技有限公司推出的Cdc42活性檢測試劑盒主要是依據單克隆抗體能夠特異性的識別Cdc42-GTP結合蛋白，而不識別Cdc42-GDP結合蛋白，進而簡單并且快速的進行Cdc42的活性檢測。每個試劑盒可以進行 30 次免疫親和沉淀檢測。同時試劑盒中的 Cdc42- GTP 單克隆抗體也可以通過免疫組化和免疫熒光對細胞和組織中的Cdc42的活性進行監測.

 

 

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| 檢測原理

 

  武漢紐萊生物科技有限公司的 Cdc42 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構象的 Cdc42-GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行 GTPγS 活化處理）活性 Cdc42-GTP 的水平。簡言之，特異性識別 Cdc42 活化構象的鼠單克隆抗體可以特異性結合細胞裂解液中的 Cdc42-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G將抗原抗體的結合物吸附下來，再利用特異性識別 Cdc42 的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。

 

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| 試劑盒組份及儲存

 

 

名稱	貨號	規格	儲存溫度
Anti-active Cdc42 mouse Monoclonal antibody	Cat.#NL23003	1x35ul	-20℃
Protein A/G Agarose	Cat.#NL30301	1x600ul	4℃
5xAssay/ lysis Buffer	Cat.#NL30303	1x30ml	4℃
Anti-Cdc42 Rabbit polyclonal antiboy	Cat.#NL24003	1x50ul	-20℃
100xGTP-rS	Cat.#NL30302	1x50ul	-80℃
100XGDP	Cat.#NL30304	1x50ul	-80℃
HRP-Goat anti-Rabbit IgG	Cat.#NL29002	1x50ul	-20℃

 

注意:使用前應將100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復凍融。

 

試劑盒所需自備物品。

 

1.刺激和未刺激的細胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測試劑；

 

試劑盒注意事項

 

1.收到試劑盒后如不立即使用，請將試劑盒組分按照標簽說明存儲在相應的溫度，100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復凍融。 

2.Protein A/G Agarose使用前請稍微離心甩一下，因管壁上可能殘留，而且是用20%乙醇保存的，如果乙醇揮發，體積較少時很難將Agarose吹散，所以請補充20%乙醇等于Agarose的體積。

3.使用50% 的Protein A/G Agarose前先用槍將其吹勻，一個反應管使用20 ul的50% 的Protein A/G Agarose足夠。

4. 將50% 的Protein A/G Agarose加入反應管前先用1×Assay/Lysis Buffer洗滌3遍，以去除其中的乙醇，最后一遍用合適體積的1×Assay/Lysis Buffer懸浮Agarose，再分裝于 反應管，保證每管參與反應的50% 的Protein A/G Agarose有20 ul。

5. 為了減少50% 的Protein A/G Agarose的損失，可以先在反應管中加入適當體積的1×Assay/Lysis Buffer。

6. 反應管中試劑加入順序建議，先1×Assay/Lysis Buffer，然后是用Buffer稀釋的Protein A/G Agarose，細胞裂解液和活性抗體，總體積建議0.5ml-1ml

7. 活性抗體的加入量請適當做調整，如可以加入0.5ug、1ug或者2ug。

8. 孵育反應在4℃ 360度搖床進行。

9. 反應完畢，洗滌Agarose時候，盡量避免吸走Agarose。

 

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| 實驗操作步驟

 

A    試劑制備

 

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B    樣品處理

 

        貼壁細胞

 

1.培養細胞密度達到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制劑進行處理. 

2.吸去培養基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3.向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養皿中加入 0.5-1mL）。

4.將培養皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5.用細胞刮棒把細胞從培養皿下分離下來。

6.將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7.如果核發生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時，將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現。

8.4°C 12000 g, 離心 10 min。

9.收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

        懸浮細胞

 

1.培養細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。

2.計數細胞后離心。

3.吸去培養基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4.向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養皿中加入 0.5-1mL）。

5.反復吹打細胞進行裂解。

6.將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7.如果核發生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時，將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現。    

8.4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用GTPγS/GDP處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）

 

注意：在細胞體內環境條件下大約有 10%的 Cdc42`被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Cdc42 被激活。 

1. 準備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物（如果是純的 Cdc42 蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。

2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應 30 min 并不斷攪動。

5. 終止反應：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D.激活 Cdc42 的親和沉淀

 

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。

2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的總體積調整到1ml 

3. 向管中加入 1ul 的活性 Cdc42 單克隆抗體。(Cat.# NL23003)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進行搖動。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實驗 

 

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA Anti-Cdc42 pAb(Cat.#NL23003),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據樣品中含有的 Cdc42 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

11. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。

 

   示例結果

 

下圖展示的是本公司的 Cdc42 活性試劑盒的典型結果。下面的數據僅供參考。

                    

           

           

 

圖一: αGC處理過的細胞裂解物（500ul,1mg/ml) 與 ProteinA/G 和 Anti- Cdc42-GTP Monoclonal Antibody  (1ul ,1mg/ml  Cat #  NL-23003)  進行孵育， 用 Anti- Cdc42 rabbit polyclonal antibody (稀釋比例，1:1000，Cat # NL-24003)  進行蛋白印跡分析.

 

圖二:  細胞裂解物（25ul ,1mg/ml), 用 Anti- Cdc42 rabbit polyclonal antibody (稀釋1:1000，Cat # NL-24003)  進行蛋白印跡分析.

 

圖三：細胞裂解物（25ul ,1mg/ml), 用 Anti- Actin rabbit polyclonal antibody (稀釋1:1000，Cat # NL-28002)  進行蛋白印跡分析.

  

          

 

                  

                    與傳統的 GST- pull down 方法相比，該試劑盒具有以下明顯優勢

 

 

1. 靈敏度高；誘導蛋白與目標蛋白中的結合對蛋白量的要求比較高。而抗體與蛋白的結合對樣本中蛋白的要求比較少。

2. 特異性強；因為誘餌蛋白是需要加上GST標簽的重組蛋白，所以是非生理狀態下的驗證，蛋白質的結構和形式可能與天然狀態下存在一定差異，而抗體與目標蛋白的結合 ，活細胞狀態下蛋白質之間的相互作用被保持，所以其反映的是細胞中真實的蛋白情況.

3. 應用更為廣泛；試劑盒中能夠特異性識別GTP結合狀態的三聚體G蛋白或者小G蛋白的單克隆抗體，適應各種種屬（Human，Mouse，Rat，Rice plants，Pig Cotton，bacteria，Escherichia coli等）應用范圍非常廣泛（ IP ,WB ,IHC IF ICF,ICC,IHF.FC,Elisa 等）隨著這些應用的普及，G 蛋白信號轉導的研究進展，必將進一步加快。