| 用途
本試劑盒用于測定樣品中 N-羥乙酰神經氨酸（Neu5Gc）的含量。
| 實驗原理
本試劑盒應用酶聯免疫競爭法測定標本中 N-羥乙酰神經氨酸（Neu5Gc)水平。用純化的 N-羥乙酰神 經氨酸(Neu5Gc）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中加入 N-羥乙酰神經氨(Neu5Gc）和HRP 標記的 N-羥乙酰神經氨酸(Neu5Gc）抗原，使它們競爭結合，經過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。樣本顏色的深淺和樣品中的 N-羥乙酰神經氨酸（Neu5Gc）的含量呈負相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD值)，通過標準曲線計算樣品中 N-羥乙酰神經氨酸（Neu5Gc）的含量。
| 基本性能
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性能 |
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靈敏度 |
1.75ng/L
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檢測范圍 |
5ng/L-350ng/L
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特異性 |
可檢測樣本中 N-羥乙酰神經氨酸（Neu5Gc）的的含量。且與其他類似物無明顯交叉反應.
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重復性 |
板內，板間變異系數均《10%
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| 試劑盒組份及儲存
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中文名稱 |
規格 |
開封后保存條件 |
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ELISA 酶標板 |
96T : 8 孔×12 條 48T : 8 孔×6 條 |
2-8℃ 90天 |
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標準品 |
SI :320ng/L S2:160ng/L S3:80ng/L S4: 40ng/L S5:20ng/L
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2-8℃ 90天 |
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HRP標記抗體 |
96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 |
2-8℃ 90天 |
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樣品稀釋液 |
96T : 1.5mlx1 48T : 1mlx1 |
2-8℃ 180天 |
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顯色劑A |
96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 |
2-8℃(避光） 180天 |
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顯色劑B |
96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 |
2-8℃(避光） 180天 |
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終止液 |
96T : 6mlx1 48T : 3mlx1 |
2-8℃ 180天 180天 |
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30倍濃縮洗滌液 |
96T : 20mlx1 48T : 10mlx1 |
2-8℃ 180天 180天 |
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說明書 |
1份 |
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質檢報告 |
1份 |
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密封袋 |
1個 |
說明；未拆封的試劑盒可以在2-8℃ 保存六個月.
| 試劑盒所需自備物品。
1.酶標儀(450nm波長濾光片)
2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3.37℃恒溫箱
4. 雙蒸水或去離子水
5. 吸水紙
6. 加樣槽
| 樣品收集方法（具體處理方法請咨詢）
1. 血清：用無菌管收集，室溫血液自然凝固10-20分鐘，2-8℃條件離心20分鐘左右 （2000-3000轉/分）仔細收集上清，保存過程中 如出現沉淀，應再次離心。
2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成應該再次離心。
3. 尿液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
4. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將剪碎的組織與 對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9 mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適 當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步 裂解組織細胞，可以對勻漿液進行反復凍融或超聲破碎。最后將勻漿液于2-8℃，5000×g 離心5-10分鐘取 上清檢測。
5. 細胞提取液：貼壁 細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞。懸浮 細胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每106個細胞中加入150-200 μL PBS重懸(推薦在PBS 中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可減少PBS的體積)并通過反復凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。
6. 細胞培養上清或其他生物體液；收集液體后于2-8℃，1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片，取上清檢測。
| 試劑盒注意事項
1. 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未 用完，板條應裝入密封袋中保存。
2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
3. 各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好 控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。
4. 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本 OD 值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品 稀釋液稀釋一定倍數（n 倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（n×5)
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物請避光保存。
7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.
8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9. 本試劑不同批號組分不得混用。
| 標本收集注意事項
1. 若標本為勻漿組織：用丁醇：甲醇：水(5：25：70 V：V：V）配比出來的液體，替代PBS，其余操作一樣。
2. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
3. 標本采集后盡快進行實驗，若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
4. 我們羅列的是通用的樣本處理方法，無法涵蓋各種樣本，對于一些特殊樣本，建議實驗人員多參考已發表的文獻， 自行設計合理的樣本 處理方法。
| 操作步驟
1. 加樣：分別設標準孔、空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上標準孔中加 50 微升，待測樣品 孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
2. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 60 分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。
6. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 分鐘.
7. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
8. 測定：以空白孔調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液后 15 分鐘以內進行。
| 結果判斷
1. 每個標準品和標本的OD 值應減去空白孔的OD值。
2. 以標準品的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，利用計算機軟件采用直線回歸的擬合方法創建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。
3. 若樣本的OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。
| 示例曲線
由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術、洗板技術和穩定條件等），標準曲線的OD值會有所差異。詳情請看質檢報告.
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