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| 用途

 

    體內(nèi) Rab5B 激活水平的分析。

    檢測增強 Rab5B 活性的化合物和蛋白質(zhì)。

    檢測抑制 Rab5B 活性的化合物和蛋白質(zhì)。

    對細胞（組織）中的 Rab5B 活性進行定位、定性、定量研究。

 

 

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| 產(chǎn)品說明

 

    Rab5B是Rab蛋白家族成員之一,屬于小GTP酶。Rab5B 與Rab5A 有極高的相似性，在內(nèi)吞途徑和分泌途徑發(fā)揮重要的功能，目前還沒有直接測定Rab5B GTPases激活的方法 .

 

   武漢紐萊生物科技有限公司推出的 Rab5B 活性檢測試劑盒主要是依據(jù)單克隆抗體能夠特異性的識別 Rab5-GTP結(jié)合蛋白，而不識別 Rab5-GDP結(jié)合蛋白，進而簡單并且快速的進行 Rab5B 的活性檢測。每個試劑盒可以進行 30 次免疫親和沉淀檢測。同時試劑盒中的 Rab5- GTP 單克隆抗體也可以通過免疫組化和免疫熒光對細胞和組織中的 Rab5B 的活性進行監(jiān)測.

 

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| 檢測原理

 

    武漢紐萊生物科技有限公司的 Rab5B 活性檢測試劑盒主要是利用識別蛋白特異構(gòu)象的 Rab5-GTP 單克隆抗體特異性的去檢測細胞提取物或者體外的（樣品需要進行 GTPγS 活化處理）活性Rab5-GTP的水平。簡言之，特異性識別 Rab5 活化構(gòu)象的鼠單克隆抗體可以特異性結(jié)合細胞裂解液中的 Rab5-GTP 活性蛋白，然后利用Protein A/G將抗原抗體的結(jié)合物吸附下來，再利用特異性識別 Rab5B的兔多克隆抗體進行免疫印跡分析進行檢測。

 

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| 試劑盒組份及儲存

       

名稱	貨號	規(guī)格	儲存溫度
Anti-active Rab5 mouse Monoclonal antibody	Cat.#NL23004	1x35ul	-20℃
Protein A/G Agarose	Cat.#NL30301	1x600ul	4℃
5xAssay/ lysis Buffer	Cat.#NL30303	1x30ml	4℃
Anti-Rab5B Rabbit polyclonal antiboy	Cat.#NL24004B	1x50ul	-20℃
100xGTP-rS	Cat.#NL30302	1x50ul	-80℃
100XGDP	Cat.#NL30304	1x50ul	-80℃
HRP-Goat anti-Rabbit IgG	Cat.#NL29002	1x50ul	-20℃

 

注意:使用前應(yīng)將100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復(fù)凍融。

 

試劑盒所需自備物品。

 

1.刺激和未刺激的細胞裂解物；

2. 蛋白酶抑制劑；

3. 4 °C 搖桿或者搖床；

4. 0.5 M EDTA (pH 8.0)；

5. 1 M MgCl2；

6. 2X reducing SDS-PAGE sample buffer；

7. 電泳和免疫印跡相關(guān)試劑；

8. 免疫印跡緩沖液 TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)；

9. 免疫印跡封閉緩沖液 (TBST containing 5% 脫脂奶粉 or 3% BSA)；

10 ECL 檢測試劑；

 

試劑盒注意事項

 

1.收到試劑盒后如不立即使用，請將試劑盒組分按照標(biāo)簽說明存儲在相應(yīng)的溫度，100xGTP-rs和100xGDP 分裝成10管/5ul/每管，并立即放入 -80℃ 凍存，避免反復(fù)凍融。 

2.Protein A/G Agarose使用前請稍微離心甩一下，因管壁上可能殘留，而且是用20%乙醇保存的，如果乙醇揮發(fā)，體積較少時很難將Agarose吹散，所以請補充20%乙醇等于Agarose的體積。

3.使用50% 的Protein A/G Agarose前先用槍將其吹勻，一個反應(yīng)管使用20 ul的50% 的Protein A/G Agarose足夠。

4. 將50% 的Protein A/G Agarose加入反應(yīng)管前先用1×Assay/Lysis Buffer洗滌3遍，以去除其中的乙醇，最后一遍用合適體積的1×Assay/Lysis Buffer懸浮Agarose，再分裝于 反應(yīng)管，保證每管參與反應(yīng)的50% 的Protein A/G Agarose有20 ul。

5. 為了減少50% 的Protein A/G Agarose的損失，可以先在反應(yīng)管中加入適當(dāng)體積的1×Assay/Lysis Buffer。

6. 反應(yīng)管中試劑加入順序建議，先1×Assay/Lysis Buffer，然后是用Buffer稀釋的Protein A/G Agarose，細胞裂解液和活性抗體，總體積建議0.5ml-1ml

7. 活性抗體的加入量請適當(dāng)做調(diào)整，如可以加入0.5ug、1ug或者2ug。

8. 孵育反應(yīng)在4℃ 360度搖床進行。

9. 反應(yīng)完畢，洗滌Agarose時候，盡量避免吸走Agarose。

 

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| 實驗操作步驟

 

A    試劑制備

 

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將 5X 的 Assay/Lysis 緩沖液稀釋成 1X 的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制劑如 1 mM PMSF, 10 µg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 µg/mLaprotinin（抑肽酶）。 

 

B    樣品處理

 

        貼壁細胞

 

1.培養(yǎng)細胞密度達到大約 80%-90%之間（直徑 10 cm 培養(yǎng)皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制劑進行處理. 

2.吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

3.向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

4.將培養(yǎng)皿放置于冰上處理 10-20 分鐘。

5.用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6.將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7.如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現(xiàn)。

8.4°C 12000 g, 離心 10 min。

9.收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

        懸浮細胞

 

1.培養(yǎng)細胞并用活化劑或抑制劑進行處理。

2.計數(shù)細胞后離心。

3.吸去培養(yǎng)基并用冰冷的 PBS 洗滌兩次。

4.向細胞中加入 1X Assay/Lysis 緩沖液（每個直徑 10cm 的組織培養(yǎng)皿中加入 0.5-1mL）。

5.反復(fù)吹打細胞進行裂解。

6.將細胞裂解物轉(zhuǎn)入合適的管中并放置于冰上。

7.如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當(dāng)這種情況出現(xiàn)時，將細胞裂解物用 27½的注射器針頭來回吸取 3-4 次，以破壞基因組DNA,從而避免上述情況的出現(xiàn)。    

8.4°C 12000 g, 離心 10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg 總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C 條件下。

 

C.體外用GTPγS/GDP處理蛋白以用作陽性和陰性的對照(可選）

 

注意：在細胞體內(nèi)環(huán)境條件下大約有 10%的 Rab5 被激活，而在體外用 GTPγS 處理大約有90%的 Rab5 被激活。 

1. 準(zhǔn)備兩個離心管，每個管中各加入 0.5 mL 的細胞提取物（如果是純的 Rab5 蛋白則每個管中加入的蛋白量為 1ug）。

2. 每個管中加入 20ul 0.5M EDTA(終濃度即為 20 mM)。

3. 一個管中加入 5ul 的 100X GTPγS（終濃度即為 100 uM）作為陽性對照。另一個管中加入 5ul 的 100X GDP（終濃度即為 1 mM）作為陰性對照。

4. 將離心管置于 30°C 條件下反應(yīng) 30 min 并不斷攪動。

5. 終止反應(yīng)：將管置于冰上并加入 32.5ul 1M MgCl2(終濃度即為 60mM)。 

 

D.激活 Rab5 的親和沉淀

 

1. 加入 0.5-1 mL(總蛋白的含量大約為 1mg)的細胞裂解物至微量離心管中。

2. 用1X Assay/Lysis 緩沖液。把每個樣品的總體積調(diào)整到1ml 

3. 向管中加入 1ul 的活性 Rab5 單克隆抗體。(Cat.# NL23004)

4. 用渦旋振蕩儀將 protein A/G 凝膠柱充分混勻，

5 .然后快速的吸出 20ul 懸浮珠漿液加入離心管中。

6. 將管置于 4°C 條件下孵育1小時，并輕輕的進行搖動。

7. 5000g，離心 1 分鐘。

8. 棄上清，這一步要非常小心以避免珠子的損失。

9. 用 0.5 mL 的 1X Assay/Lysis 緩沖液洗滌珠子三次，離心并棄去上清。

10. 最后一次洗滌后，小心的移去所有的上清。

11. 用 20ul 的 2X SDS-PAGE 樣品緩沖液重懸樣品。

12. 樣品煮沸 5min。 

13. 5000g，離心 10s。

 

E. 蛋白印跡實驗 

 

1. 取 15ul 樣品/孔上樣 17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進行 SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF 或硝化纖維素膜。 

4. 將 PVDF 膜浸入 100%甲醇 15s，然后在室溫放置 5 min 晾干。 注意：如果使用的是硝化纖維 素膜，此步省略。 

5. 封閉； 用 TBST 緩沖液配制 5%的脫脂牛奶或者 3%BSA 在室溫下孵育 1小時進行封閉，并需要恒定振蕩。 

6 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 孵育一抗：用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA Anti-Rab5B pAb (Cat.#NL24004B),稀釋比例為 1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的 Rab5B 蛋 白的量）室溫下孵育 1-2 小時，或者 4°C 條件下過夜孵育.

8. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

9. 孵育二抗：（例如羊抗兔 IgG-HRP）用 TBST 緩沖液配制的 5%脫脂牛奶或 3%BSA 按1:1000 稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育 1 小時并恒定振蕩。

10. 用 TBST 緩沖液洗滌膜三次/5min。

11. 使用實驗者所選擇的檢測方法進行顯色如 ECL 顯色法。

 

   示例結(jié)果

 

下圖展示的是本公司的 Rab5B 活性試劑盒的典型結(jié)果。下面的數(shù)據(jù)僅供參考。

 

                  

                          

                          

                     

 

純化的 His-Rab5B 蛋白用GDP處理 (lane 1) 或 GTPγS (lane 2)與 ProteinA/G 和 Anti-Rab5-GTP Monoclonal Antibody  (1ul ,1mg/ml  Cat # NL23004)  進行孵育， 用 Anti- Rab5B  Rabbit polyclonal antibody (稀釋比例，1:1000，Cat # NL24004B)  進行蛋白印跡分析.

      

  

   

                    

                    與傳統(tǒng)的 GST- pull down 方法相比，該試劑盒具有以下明顯優(yōu)勢

 

 

1. 靈敏度高；誘導(dǎo)蛋白與目標(biāo)蛋白中的結(jié)合對蛋白量的要求比較高。而抗體與蛋白的結(jié)合對樣本中蛋白的要求比較少。

2. 特異性強；因為誘餌蛋白是需要加上GST標(biāo)簽的重組蛋白，所以是非生理狀態(tài)下的驗證，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和形式可能與天然狀態(tài)下存在一定差異，而抗體與目標(biāo)蛋白的結(jié)合 ，活細胞狀態(tài)下蛋白質(zhì)之間的相互作用被保持，所以其反映的是細胞中真實的蛋白情況.

3. 應(yīng)用更為廣泛；試劑盒中能夠特異性識別GTP結(jié)合狀態(tài)的三聚體G蛋白或者小G蛋白的單克隆抗體，適應(yīng)各種種屬（Human，Mouse，Rat，Rice plants，Pig Cotton，bacteria，Escherichia coli等）應(yīng)用范圍非常廣泛（ IP ,WB ,IHC IF ICF,ICC,IHF.FC,Elisa 等）隨著這些應(yīng)用的普及，G 蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究進展，必將進一步加快。