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| 用途

    本試劑盒用于測定樣本中甲硫氨酸（Met）的含量。

| 實驗原理

    本試劑盒應(yīng)用酶聯(lián)免疫競爭法測定標(biāo)本中甲硫氨酸（Met）水平。用純化的甲硫氨酸（Met）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中加入甲硫氨酸（Met），和HRP 標(biāo)記的甲硫氨酸（Met）抗原，使它們競爭結(jié)合，，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。樣本顏色的深淺和樣品中的甲硫氨（Met）的含量呈負(fù)相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中甲硫氨酸（Met）的含量。

| 基本性能

| 試劑盒組份及儲存

說明；未拆封的試劑盒可以在2-8℃ 保存六個月.

| 試劑盒所需自備物品。

 1.酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片) 

 2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 

 3.37℃恒溫箱 

 4. 雙蒸水或去離子水 

 5. 吸水紙 

 6. 加樣槽

| 樣品收集方法（具體處理方法請咨詢）

1.  血清：用無菌管收集，室溫血液自然凝固10-20分鐘，2-8℃條件離心20分鐘左右  （2000-3000轉(zhuǎn)/分）仔細(xì)收集上清，保存過程中  如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2.  血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成應(yīng)該再次離心。

3.  尿液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

4. 組織勻漿：用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將剪碎的組織與 對應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9 mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適 當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步 裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行反復(fù)凍融或超聲破碎。最后將勻漿液于2-8℃，5000×g 離心5-10分鐘取 上清檢測。

5.  細(xì)胞提取液：貼壁 細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞。懸浮 細(xì)胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS洗滌3次。每106個細(xì)胞中加入150-200 μL PBS重懸(推薦在PBS 中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可減少PBS的體積)并通過反復(fù)凍融或超聲使細(xì)胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。

6. 細(xì)胞培養(yǎng)上清或其他生物體液；收集液體后于2-8℃，1000×g離心20分鐘，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片，取上清檢測。

| 試劑盒注意事項

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未 用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。 

2. 濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。 

3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。 

4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本 OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品 稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（n×5) 

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 

6. 底物請避光保存。 

7. 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn). 

8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。 

9. 本試劑不同批號組分不得混用。

|  標(biāo)本收集注意事項

1. 若標(biāo)本為勻漿組織：用丁醇：甲醇：水(5：25：70 V：V：V）配比出來的液體，替代PBS，其余操作一樣。
2. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
3. 標(biāo)本采集后盡快進(jìn)行實驗，若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
4. 我們羅列的是通用的樣本處理方法，無法涵蓋各種樣本，對于一些特殊樣本，建議實驗人員多參考已發(fā)表的文獻(xiàn)， 自行設(shè)計合理的樣本 處理方法。

|  操作步驟

1. 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)孔中加 50 微升，待測樣品  孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
2. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50μl，空白孔除外。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 60 分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。
6. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 分鐘.
7. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
8. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應(yīng)在加終止液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

|  結(jié)果判斷

 1. 每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD 值應(yīng)減去空白孔的OD值。

 2. 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，利用計算機(jī)軟件采用直線回歸的擬合方法創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。

 3. 若樣本的OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測，計算濃度時應(yīng)乘以稀釋倍數(shù)。

 |  示例曲線

 由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和穩(wěn)定條件等），標(biāo)準(zhǔn)曲線的OD值會有所差異。詳情請看質(zhì)檢報告.

ELISA實驗操作流程 (1) (5).docx

樣本處理方法1.docx

競爭法質(zhì)控報告 -甲硫氨酸（Met）.doc