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| 用途

    本試劑盒用于測定血清，血漿及相關液體樣本中 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的含量。

| 實驗原理

    本試劑盒應用酶聯免疫競爭法測定標本中 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水平。用純化的 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中加入 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH），和 HRP 標記的 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）抗原，使它們競爭結合，經過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。樣本顏色的深淺和樣品中的 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的含量呈負相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過標準曲線計算樣品中 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）的含量。

| 基本性能

| 試劑盒組份及儲存

說明；未拆封的試劑盒可以在2-8℃ 保存六個月.

| 試劑盒所需自備物品。

 1.酶標儀(450nm波長濾光片) 

 2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 

 3.37℃恒溫箱 

 4. 雙蒸水或去離子水 

 5. 吸水紙 

 6. 加樣槽

| 樣品收集方法（具體處理方法請咨詢）

1.  血清：用無菌管收集，室溫血液自然凝固10-20分鐘，2-8℃條件離心20分鐘左右  （2000-3000轉/分）仔細收集上清，保存過程中  如出現沉淀，應再次離心。

2.  血漿：應根據標本的要求選擇EDTA、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成應該再次離心。

3.  尿液：用無菌管收集，2-8℃條件離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

4. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液，稱重后將剪碎的組織與 對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9 mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適 當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中，在冰上充分研磨。為了進一步 裂解組織細胞，可以對勻漿液進行反復凍融或超聲破碎。最后將勻漿液于2-8℃，5000×g 離心5-10分鐘取 上清檢測。

5.  細胞提取液：貼壁 細胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞。懸浮 細胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每106個細胞中加入150-200 μL PBS重懸(推薦在PBS 中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可減少PBS的體積)并通過反復凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。

6. 細胞培養上清或其他生物體液；收集液體后于2-8℃，1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片，取上清檢測。

| 試劑盒注意事項

1. 加樣：分別設標準孔、空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上標準孔中加 50 微升，待測樣品  孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
2. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 60 分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。
6. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 分鐘.
7. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
8. 測定：以空白孔調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液后 15 分鐘以內進行。  

|  標本收集注意事項

1. 若標本為勻漿組織：用丁醇：甲醇：水(5：25：70 V：V：V）配比出來的液體，替代PBS，其余操作一樣。
2. 不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
3. 標本采集后盡快進行實驗，若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。
4. 我們羅列的是通用的樣本處理方法，無法涵蓋各種樣本，對于一些特殊樣本，建議實驗人員多參考已發表的文獻， 自行設計合理的樣本 處理方法。

|  操作步驟

1.加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、 待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液. 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品最
終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底 ）部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
2.溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
3.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此 重復 5 次，拍干。
4.加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。
5.溫育：操作同 2
6.洗滌：操作同 3
7.顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色 10 分鐘.
8.終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。
9.測定：以空白孔調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終 止液后 15 分鐘以內進行。

|  結果判斷

 1. 每個標準品和標本的OD 值應減去空白孔的OD值。

 2. 以標準品的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，利用計算機軟件采用直線回歸的擬合方法創建標準曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。

 3. 若樣本的OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

 |  示例曲線

 由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術、洗板技術和穩定條件等），標準曲線的OD值會有所差異。詳情請看質檢報告.

ELISA實驗操作流程 (1) (5).docx

樣本處理方法1.docx

競爭法質控報告 -S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）.doc