| 用途
該試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿。組織勻漿，細胞裂解液，細胞培養上清，或其他相關生物液體中天然cGMP濃度。
| 基本性能
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性能 |
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靈敏度 |
18.4 fmol/ml
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檢測范圍 |
0.08pmol/ml-250pmol/ml
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特異性 |
可檢測樣本中cGMP (環磷酸鳥苷）的含量。且與其他類似物無明顯交叉反應。
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重復性 |
板內，板間變異系數均《10%
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| 產品說明
cGMP 是小分子的環狀核苷酸，以微量存在于動植物細胞和微生物中，被稱其為細胞內的第二信使（激素為第一信使）。cGMP 由鳥苷酸環化酶產生，被磷酸二酯酶降解，因此激活鳥苷酸環化酶 或者抑制磷酸二酯酶，可以提高細胞內 cGMP 的含量。研究發現，cGMP 特異性磷酸二酯酶的抑制劑可用于人類疾病的治療。如：cGMP 特異性磷酸二酯酶類型5可用于治療 ED 等疾病。 cGMP 分子量只有345.21。所以cGMP的定量分析多采用競爭結合法,且cGMP在機體內的含量極低，為 pmol/L 級別，所以一種靈敏度高，特異性強。重復性高的 cGMP ELISA 檢測試劑盒是廣大 科研工作者，最理想的選擇。
本公司開發了一種基于鼠單克隆抗體的 cGMP ELISA 檢測試劑盒。該單克隆抗體對cGMP的 特異性比cGMP、ATP等類似的小分子高出108 倍以上。相較于其他的多克隆抗體cGMP試劑盒 ，我公司的 cGMP ELISA試劑盒能顯著的提高其靈敏性和特異性 ，且能有效避免來自動物多克隆抗體的批次間差異 因此可以提供長久有效地可重復性定量檢測。
| 實驗原理
本試劑盒利用競爭酶聯免疫分析方法來測定細胞提取物或體外腺苷酸環化酶實驗中的 cGMP 的水平。包被羊抗鼠多克隆抗體在酶標板上，細胞提取物或體外腺苷酸環化酶實驗中的cGMP 與固定數量的標記辣根過氧化物酶的 cAMP 競爭性的結合抗 cAMP單克隆抗體，采用已知濃度的 cGMP 標準品來做標準曲線。用酶標儀 在 450 nm 波長處測 OD 值，cGMP 濃度與 OD450值之間呈反比，通過繪制標準曲線計算出樣品中 cGMP 的濃度。
| 研究背景
cGMP作為獨特的第二信使 ,可調節細胞對各種外源和內源信號分子的反應. cGMP主要通過 激活蛋白激酶,控制特定的離子通道,磷酸二酯酶調節細胞環核苷酸濃度來調節不同的生理過程 ,如血管平滑肌松弛,上皮細胞電解質運輸, 骨生長, 白細胞遷移, 軸突引導, 精子運動, 血小板蔓延以及血管通透性等。
通過鳥苷酸環化酶可以實現GTP轉化為cGMP。在哺乳動物中 ，存在2種類型的鳥苷酸環化酶: 可溶性及膜結合的鳥苷酸 環化酶(8,10,11)。可溶性環化酶在一氧化氮與血紅素輔基結合后 ，即被激 活。七層膜結合鳥苷酸環化酶 (即跨膜鳥苷酸環化酶或鳥苷酸環化酶微粒) 已被證實存在于人類基 因組中 ，鳥苷酸環化酶A和B是利尿鈉肽受體 ，鳥苷酸環化酶C能被熱穩定細菌腸毒素、鳥苷素和脲 激活。跨膜鳥苷酸環化酶的活性亦受胞內信號通路的其他受體信號所調控。
| 試劑盒組份及保存
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中文名稱 |
規格 |
開封后保存條件 |
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ELISA 酶標板 Goat anti-Mouse IgG Coated plate of 96 wells |
96T: 8孔 x12 條 48T: 8孔 x 6 條 |
2-8℃ 90天 |
| Assay Buffer A |
96T: 1x6ml 48T: 1X3ml |
2-8℃ 90天 |
| 0.1M HCl |
96T: 1X30ml 48T: 1X15ml |
2-8℃ 90天 |
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cGMP 標準品 |
96T: 1x0.1ml 48T: 1X0.05ml (5000pmol/ml) |
-80℃ 180天 |
| 10XAssay Buffer |
96T: 1x15ml 48T: 1x7.5ml |
2-8℃ 90天 |
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濃縮cGMP 鼠單抗（1000x) Anti- cGMP monoclonal antibody (1000 X) |
96T: 1x6ul 48T: 1x3ul |
-80℃ 180天 |
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濃縮 cGMP-HRP (1000x) HRP conjugated with cGMP (1000x) |
96T: 1x6ul 48T: 1x3ul |
-80℃ 180天 |
| 顯示液A substrate A |
96T:1x12ml 48T:1x6ml |
2-8℃ (避光）90天 |
| 顯示液B substrate B |
96T:1x12ml 48T:1x6ml |
2-8℃ (避光）90天 |
| 終止液 stop solution |
96T: 1x6ml 48T: 1x3ml |
2-8℃ 90天 |
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封板覆膜 |
3個 |
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| 產品說明書 Manual |
1份 |
注：收到試劑盒后 ，若不立即使用 ，請按照標簽說明存儲在相應的溫度。CAMP-HRP 濃縮液，及A,B顯色液應避光保存。
| 試劑盒所需自備物品
| 樣品處理
組織樣本：需預先冰凍于液氮中。在不銹鋼研缽中用液氮將組子樣本研磨成精細粉末。待液氮揮發完后 ，稱量冰凍組織樣本并加入10倍體積的0.1M
HCl混勻。室溫以大于600g離心力離心 ，取上 層清夜用0.1M HCl稀釋至適當濃度。
細胞樣本：首先移除培養基 ，然后加入0.1M HCl處理細胞。孵育10分鐘 并觀察細胞是否被裂解；如果裂解充分 ，接著孵育10分鐘并觀察，以大于
600g離心力于室溫離心 ，收集上清直接用于實驗。 臨用前在0.1M HCl中加入0.1%至1%濃度的Triton-x 100可增強細胞和組織裂解。
尿液，血漿和培養液 ： 每1ml樣品中加入1.2ml (0.1Mol) 鹽酸混勻后，室溫離心5min（600 g）留上清，用于本試劑盒檢測。因為，血漿、血清、全血和組織勻漿通常含有磷酸二酯酶（phosphodiesterases）和大量免疫球蛋白（Ig），它們會干擾實驗。用0.1 M HCl處理樣品，可以滅活磷酸二酯酶和降低免疫球蛋白的濃度，能更加精準的檢測樣本中cGMP的濃度。
備注：我公司的試劑盒，適用于檢測經過鹽酸處理的樣品，因內源性磷酸二脂酶具有水解細胞內第二信使 cGMP濃度。而用0.1M鹽酸處理樣本可以終止內源性磷酸二脂酶的活性能更加精準的檢測樣本中cGMP的 水平。
| 試劑盒注意事項
1. 收到試劑盒后若不立即使用 ，請將試劑按照標簽說明存儲在相應的溫度 ， -80℃低溫保存的抗體和 酶儲液為避免反復凍融請按每次需要量進行分裝凍存；若立即使用，請將整個試劑盒置于4℃保存。
2. 使用前請將試劑盒各個試劑平衡到室溫 (至少30min) 。
3. 用試劑預先潤洗槍頭在使用；取各種樣品、標準品和試劑必需更換槍頭。
4. 移取標準品和樣品到微孔底部。
5. 從微孔的邊緣加入試劑 ，以避免污染。
6. 本試劑盒使用可拆分的微孔酶標條 ，使用者可根據樣品量多少進行拆分。未使用的酶標條保持干 燥 ，密封于試劑盒提供的鋁封袋中 ，于4℃保存。微孔酶標條需安裝在相應的框架上使用。
7. 在加入顯色底物前 ，確保微孔內沒有殘留的洗滌液。微量殘留的洗滌液可能導致分析結果的變化。
| 檢測前準備工作
1. 提前30分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫(18-25℃)。如果試劑盒需分 多次使用，請僅取出本次實驗所需的酶標板條和試劑，剩余板條和試劑需 按照指定條件保存。
2. 1x Assay Buffer：將15 mL 10× Assay Buffer加到135 mL去離子水中 ，稀釋成工作液。稀釋液可在室溫保存至試劑盒有效期限 ，或者3個月。
3. CGMP標準品工作液：將5000 pmol/mL cGMP標準品溶液平衡至室溫。然后根據需要進行倍比稀釋。倍比稀釋方法：從#1至#7標記七只潔凈試管。移取475μ L 0.1M HCl到#1號試管 ，400μ L到#2至#7號試管。加入25μ L 5000 pmol/mL cGMP標準品到#1管中 混勻配置成250pmol/ml 的標準品工作液。從#1管中取出100μ L溶液至#2管中，混勻。以此類推 ，重復上步操作 ，梯度稀釋至#6 管。經以上操作 ，#1至#6管中cGMP標準品濃度分別為250, 50，10, 2. ,0.4 和 0.08 pmol/mL (詳見下圖) 。提示：最后一管 #7直接作為BO孔(0 pmol/mL cGMP標準品)。，不需要再從#6管中吸取液體。 稀釋過的標準品需在30分鐘內使用。
4.cGMP-HRP Conjugate工作液：實驗前計算當次實驗所需用量 （以50ul/孔計算) ，實際配置時應多配置100-200ul.使用15分鐘，用配好的1x Assay Buffer,將cGMP-HRP Conjugate （1000×) 稀釋成1x工作濃度。當日使用。
5.Anti-cGMP Monoclonal Antibody工作液： 實驗前計算當次實驗所需用量 (以50ul/孔計算) ，實際配置時應多配置100-200ul.使用前15分鐘 ，用配好的1x Assay Buffer,將 Anti-cGMP Monoclonal Antibody ( 1000×) 稀釋成1x工作濃度當日使用。
| 實驗步驟
1.分別設定 標準孔，BO孔 (0 pmol/mL cGMP標準品)，Blank孔（空白孔） 樣品孔，建議全部設立復孔（參照下圖2） 待測樣品孔，可視實際需要， 酌情考慮。
2.移取50μ L Assay Buffer A至各個微孔中 ，除Blank(空白)孔外。
3. 移取100μ L 0.1M HCl至B0孔(0 pmol/mL cGMP標準品)。
4. 移取100μ L 倍比稀釋的cGMP標準品至相應的各標準孔。
5. 移取100μ L樣品至相應的各樣品孔。
6. 移取50μ L 偶聯酶至各孔中，除了Blank(空白)孔。
7. 移取50μ L 抗體工作液至各孔中 ，除了Blank(空白)孔。
8. 給酶標板覆膜，室溫孵育1小時。提示：加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，避免產生氣泡。加樣時間宜控制10分鐘。
9 在吸水紙上拍干微孔內溶液 ，加1x Assay Buffer 250μ L每孔洗3次 ，每次需拍干。
10.最后一次洗滌 ，清空各微孔 ，在干凈的無塵吸水紙上輕巧酶標板數次,以確保沒有洗滌液殘留。
11.每孔 200μ L顯色底物溶液 ,于室溫避光孵育10分鐘。(顯色底物A和B需在臨用前15分鐘內等體積混合,并避光放置）提示：根據實際顯色情況酌情縮短或延長，但不可超過30分鐘。當標準孔出現明顯梯度時(前4個顯色孔出現明顯藍色梯度)，即可終止。提前15分鐘打開酶標儀預熱。
12. 每孔加入50μ L終止液。終止反應。
13. 立即用酶標儀在 450 nm 波長測量各孔的光密度(OD值)。
| 操作流程圖
圖一
圖二
| 結果判斷
1. ELISA的樣本通常要設置1~2個復孔進行檢測，分別求出標準品、實驗組樣本的吸光度的平均值。單個樣本的檢測值不應超出平均值的20%
2. 用軟件ELISA Calc 的logistic 曲線擬合2（四參數）建立標準曲線（X軸上為標準品濃度，Y軸為對應的OD值）
3. 若樣品OD值低于標準曲線下限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
| 典型數據
由于實驗操作條件的不同（如操作者、移液技術、洗板技術和穩定條件等），標準曲線的OD值會有所差 異。
以下數據和曲線僅供參考，實驗者需要根據自己的實驗建立標準曲線。
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